jueves, 1 de enero de 2009

Extracción de sangre para análisis.

EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE.


(Resumen breve de artículo de C.Mèdaille y J.P. Braun de la Enciclopedia Veterinaria-Biología Clínica-E-BI-0025)

El objeto de este artículo es revisar los conocimientos actuales sobre la influencia de los diversos factores a tener en cuenta a la hora de interpretar resultados.
Pueden estar relacionados con el individuo (1) o con la obtención de muestras (2).

I. FACTORES DE VARIACIÓN ASOCIADOS AL INDIVIDUO.

Influencia de:

1.- Toma de alimentos.
2.- Stress.
3.- Estado fisiológico del animal.
4.- Ritmos biológicos.
5.- Anestesia.
6.- Medicamentos.

II. FACTORES DE VARIACIÓN ASOCIADOS A LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.

1.- Sitio y técnica de extracción.
1.1- Elección del sitio
1.2- Efecto del torniquete.
1.3- Calidad de la punción.

2.- Material.
2.1- Material de punción.
2.2- Elección del tubo de recogida.
2.3- Volumen de sangre necesario.
2.4- Homogeneización correcta de los tubos.
2.5- Llenado del tubo.

3.- Conservación y transporte.
3.1- Generalidades.
3.2- Conservación de muestras de hematología.
3.3- Efectos del envío postal.
3.4- Efectos de la conservación del suero o el plasma a 4 º C.
3.5- Efectos de la conservación a – 20º C

4.- Velocidad de centrifugación.

5.- Influencia de la hemólisis.

6.- Identificación de las muestras y las alícuotas.

7.- Tratamientos especiales de las muestras.

8.- Examen del aspecto de una muestra antes del análisis.

I. ASOCIADOS AL INDIVIDUO.

1.-Influencia de la toma de alimentos.

La falta de ayuno provoca un aumento de Glucosa, Urea y Lípidos, cuya intensidad y variaciones no pueden preverse.

La lipemia provoca turbidez que interfiere con la mayoría de los análisis bioquímicos y hematológicos.

Un ayuno de 12 horas suele ser suficiente.

2.- Influencia del stress.

El efecto más espectacular se ve en los gatos. Puede superar los 3g/l e ir acompañada de glucosuria transitoria. La fructosamina plasmática permite diferenciar la hiperglucemía transitoria de la diabetes mellitus.

Falso aumento de eritrocitos, leucocitos y concentración de hemoglobina. Se modifica la proporción de las distintas líneas leucocitarias con linfocitosis y eosinopenias relativas.

3.- Influencia del estado fisiológico.

Gestación: Aumento de eritrocitos y hemoglobina.

4.- Influencia de los ritmos biológicos.

Ritmo circadiano de baja amplitud en la actividad sérica de la AST (GOT) y creatinina.

No hay ritmo circadiano demostrado en cortisolemia en el perro (Cuando se ha observado variaciones los valores han estado dentro del intervalo de referencia).

5.- Efectos de la anestesia.

Aumento considerable de ALT (GOT) en conejos anestesiados con Ketamina-xilacina, Casi ningún efecto con Ketamina-diazepam y ninguno con fentanilo-droperidol.

6.- Efectos de los medicamentos.

Sol. De glucosa al 5%: hiperglucemia transitoria que retorna en 2 horas.

Aumento de FAS o Fe plasmático en perros tratados con corticoides.

Aumento de GGT en perros tratados con barbitúricos.

En Test de estimulación con ACTH el cortisol aumenta en los individuos sanos y aumentan los leucocitos y neutrófilos, y disminuyen los eosinófilos entre las 2 y 6 horas posteriores a la estimulación.


II. ASOCIADOS A LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.


1.- Sitio y técnica de extracción.

La obtención de sangre arterial se reserva para determinaciones de pH y gases sanguíneos. En gatos puede obtenerse con sangre capilar por incisión en uña.

Para análisis de hemostasia es mejor de vena yugular para evitar éstasis venosas prolongadas que puedan influir en la calidad.

Para la obtención de pequeñas muestras valdría la vena auricular del dorso.

Para la obtención de muestras capilares se puede hacer una punción franca del pabellón auricular. No se debe presionar, y la primera gota se desperdiciaría. Vale para frotis sanguíneos.

En aves el volumen total de sangre es el 7-10 % del peso corporal, de modo que se debe extraer 0,5-2ml con aguja de insulina y usando vena alar o yugular derecha.

En pájaros debe usarse un tubo pequeño para el total de muestra, con heparina de litio, para análisis hematológicos y bioquímicos.

La vía influye poco para la evaluación de los constituyentes del equilibrio acidobásico.

Un torniquete hace que por aumento de presión se salgan algunos electrolitos haciendo que se concentren los que no salen. Por ello hay que liberar el torniquete o compresión antes de la extracción o limitar la presión a menos de 1 minuto.

Evitar hemólisis evitando agujas de pequeño diámetro o vacío intenso.

Como regla general jamás se debe extraer sangre de catéteres IV contaminados con sangre, medicamentos, soluciones IV etc. En medicina humana se desperdicia una cantidad equivalente a varias veces el volumen muerto del catéter.

2.- Material.

2.1.- Material de punción.

La influencia del material (vidrio, poliestireno, polipropileno) no tiene importancia salvo para algunas pruebas de hemostasia (productos de degradación de la fibrina, tiempo de retracción del coágulo).

Se prefieren los tubos de vacío, salvo para determinación de Zinc (aumenta notablemente por el contacto con el tapón de gaucho), cobre y hierro (disminuyen). Son caros.

2.2.- Elección del tubo de recogida.

Hoy en día ya los laboratorios proporcionan distintos tubos con los distintos anticoagulantes identificados mediante un código de color.

En la mayoría de los análisis bioquímicos sirve suero o plasma pero en esta última la preparación es más rápida, permite obtener un mayor volumen y se producen menos hemólisis. Por otra parte en la coagulación que se produce al obtener el suero ciertas enzimas, potasio etc. Sale de las células y modifican ligeramente la composición del suero.

No obstante no se puede usar uno u otro para todos los análisis. Para la electroforesis de proteínas debe usarse suero (sin anticoagulante) debido a la interferencia del fibrinógeno con las betaglobulinas. Lo mismo pasa con los ácidos biliares o los factores reumatoides en perro.

Hemos de tener en cuenta la elección del anticoagulante.

Si vamos a hacer una glucemia y no va a hacerse de forma inmediata, o no se puede centrifugar rápidamente, debe hacerse en un plasma que contenga un inhibidor de la glucolisis pues se consume un 5%- 10% por hora a temperatura ambiente. Se inhibe por los fluoruros o la yodoacetamida( inhibidores respectivos de la enolasa y de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada respectivamente).

La determinación de iones divalentes como Calcio, Hierro, Zinc puede hacerse con plasma heparinizado o suero pero nunca en un plasma con EDTA debido a la formación de complejos iones divalentes que los hace inaccesibles a los reactivos bioquímicos usados habitualmente. Tampoco sirve éste para determinar Fosfatasas alcalinas ni potasio (falsa elevación por el EDTA-K2 o EDTA-K3) ni para la determinación de tiroxina por los métodos habituales. La determinación de algunas hormonas inestables, in vitro, solo es posible en muestras con inhibidores de la proteolisis. La inestabilidad de algunos compuestos como los cuerpos cetónicos, exigen un medio desnaturalizador de enzimas como el ácido perclórico.

La mayoría de los análisis bioquímicos suelen hacerse con plasma heparinizado aunque la heparina no sea un anticoagulante sino un retardador de la coagulación (termina coagulando la sangre).

Algunos parámetros a analizar exigen de tubos especiales, como pasa al querer determinar el zinc, que no debe hacerse en tubos normales con tapones de gaucho que tienen zinc.

En hematología, el hemograma se efectúa con sangre total conservada con EDTA.

Las pipetas capilares llevan oxalato de amonio al 1,14%.

Para pruebas de hemostasia el anticoagulante más usado es el citrato de sodio al 3,8 % que deberá estar en proporción 1:9 con respecto a la sangre.

Algunos tubos llevan un gel separador de silicona cuya densidad es intermedia entre el suero o plasma y las células, lo que asegura una separación estanca. Estos no son válidos para algunas pruebas como determinación de fenobarbital o progesterona (no se modifican para determinar estradiol, cortisol, tiroxina o triyodotironina.


2.3.- Volumen de sangre necesario.

Cuando no podemos obtener demasiada sangre debemos saber que el volumen de plasma que se puede obtener es mayor que el de suero (10-20%).

Nunca se debe completar el volumen de un tubo poco lleno con otro tubo pues existe el riesgo de interferencias asociadas a los anticoagulantes o aditivos.

2.4.- Homogeneización correcta de los tubos.

La mayor parte de los anticoagulantes se presentan en forma sólida, a menudo en las paredes del tubo. Para que sean eficaces deben repartirse en toda la muestra, de modo que los tubos deben agitarse suavemente mediante volteos lentos y delicados al menos 10 veces, excepto si se usan medios desnaturalizantes(ej. Ácido perclórico) en cuyo caso deben ser con una agitación vigorosa.
Los microcoágulos falsean los análisis hematológicos y pueden obstruir las máquinas analizadoras.

2.5.- Llenado del tubo.

Se deben seguir las recomendaciones del fabricante.
Es esencial la exactitud para las pruebas de coagulación.

3.- Conservación y transporte.

3.1. Generalidades.

Hay una serie de factores que pueden influir en la estabilidad de una muestra:

Degradación de ciertos componentes por la acción de las enzimas. Se pierde glucosa más de 7% por hora, oxidación de lactatos etc.

Liberación de componentes celulares, por ejemplo del potasio en especies con una concentración alta dentro de los eritrocitos, como el hombre o el cerdo, aunque no en el perro o gato.

Inestabilidad a la luz: La bilirrubina o los carotenos.

La volatilidad: gases sanguíneos, amonio etc.

La mayoría de los parámetros analíticos se modifican por contacto de las células con el suero o plasma, por lo que se debe separar lo antes posible, que en el caso del suero debe ser menor a 2 horas. Una vez separados se mantienen estables varias horas a medio ambiente, 1 a 3 días en refrigeración y varias semanas en congelación (-20ºC).

Algunos son inestables incluso en refrigeración como el pH, gases sanguíneos, amonio, calcio ionizado, ácidos grasos libres, lactatos y el piruvato de diversas hormonas. Se debe, por tanto, consultar al laboratorio antes del envío para asegurarse.

3.2. Conservación de muestras de hematología.

La sangre total con EDTA se conserva a 4º C en posición vertical. A las 24 horas es posible obtener datos correctos de recuentos celulares, mientras que el hematocrito aumenta ligeramente.

En medicina humana se ha estudiado el recuento automatizado y se ha demostrado que a las 48 horas a temperatura ambiente no se modifica el hemograma.

En el gato el recuento eritrocitario es estable a temperatura ambiente o a 4ºC durante 96 horas.

El envío postal con un plazo de 48 horas supone un aumento del hematocrito, del VCM y de las proteínas totales, mientras que el recuento eritrocitario y la CHCM disminuyen.

Las pruebas de hemostasia y el recuento plaquetario deben efectuarse durante las horas siguientes a la obtención de la muestra si ésta se conserva a temperatura ambiente.

Si es necesario posponer los análisis y realizarlos con plasma congelado, se efectúa previamente una doble centrifugación a 1500-2000 RPM durante 15-20 minutos; el plasma así obtenido, pobre en plaquetas, es suficiente para la realización de las pruebas de hemostasias clásicas.


3.3.- Efectos del envío postal.

Los parámetros séricos son estables durante al menos 24 horas a 4ºC y a temperatura ambiente salvo en la glucosa y fósforo inorgánico.

El envío por correo influye de forma apreciable sobre la glucosa, urea, creatinina, colesterol, fósforo y ciertas enzimas (transaminasas glutamopirúvicas, fosfatasas alcalinas y creatinquinasas).

En cambio son relativamente estables durante 48 horas, en un envío postal, las proteínas totales, albúminas, globulinas, calcio, magnesio, sodio y potasio.

Debe señalarse la excelente conservación de la tiroxina en muestras no centrifugadas, en cambio el resto de hormonas esteroideas o de insulina deben centrifugarse y separarse durante las horas siguientes a la obtención de la muestras.


3.4- Efectos de la conservación del suero o el plasma a 4 º C.


-Estabilidad satisfactoria, a 4º C, 6 semanas: Urea, Creatinina, Calcio, Fósforo y cloruros.

-Estabilidad sin notables modificaciones a 4º C ,24 horas: Fosfatasas alcalinas y transaminasas.

-Debe analizarse inmediatamente: amonio plasmático.

-Tiroxina: no influye duración y modo de conservación en resultados.

-Cortisolemia: disminuye después de 24 horas de conservación a 4º C sin centrifugación.


3.5- Efectos de la conservación a – 20º C

Estabilidad suficiente en la mayoría de enzimas y hormonas.

Excelente estabilidad de muestras de urea y bilirrubina en caballos y gatos.

El amonio aumenta de forma significativa después de las primeras 48 horas de conservación.

La insulina y cortisol inestables a Tª ambiente pueden conservarse a -20º C.


4.- Velocidad de centrifugación.


La velocidad de centrifugación recomendada es de 3000 RPM.

5.- Influencia de la hemólisis.

En el perro la hemólisis es visible cuando la cantidad de hemoglobina es superior a 0,1 g/dl.

La hemólisis puede producir:

1º. Aumento en plasma de componentes intraeritrocitarios.

2º. Dilución de de componentes séricos como Calcio y Sodio.

3º. Aumento de densidad óptica o modificación del pH de ciertas reacciones enzimáticas y alterando, por tanto, los resultados de los equipos.

Variaciones significativas de creatinina y LDH cuando la hemoglobina es igual o mayor a 0,1g/ dl (2+).

La AST (GOT) y fosfatasas alcalinas solo presentan diferencias significativas cuando la hemoglobina es mayor de 0,3g/ dl(3+)

La hemólisis en el perro no eleva el potasio, como ocurre en medicina humana, pues las concentraciones de potasio en los hematíes son diez veces menores que la del hombre.


6.- Identificación de las muestras y las alícuotas.

Debe identificarse inmediatamente.

Se debe conservar una fracción de muestra (alícuota) para poder confirmar un resultado o realizar análisis complementarios posteriores.


7.- Tratamientos especiales de las muestras.

En ciertos enfermos lipémicos, con el fin de evitar la difracción de la luz cuando se hacen mediciones espectrofotométricas, se “aclara” el plasma lipémico dejando la muestra una noche en refrigeración y retirando el sobrenadante después, o bien precipitando los lípidos con agentes como cloruro de magnesio, polietilenglicol, dextrano etc. Con éstas técnicas se permite, en el mejor de los casos una estimación de las concentraciones reales.

8.- Examen del aspecto de una muestra antes del análisis.

Las anomalías más frecuentes son:

1. Microcoágulos.

2. Coloración anómala: hemólisis, ictericia, lipemia.

Influyen dependiendo de la técnica de análisis.


Resumen del artículo: “Extracciones de muestras de sangre”. C Médaille, JP Braun. Enciclopedia Veterinaria-Biología Clínica-E-BI-0025.


Por:
Alfredo Pérez
Alicia Kabdur
Sergio González
C. V. Taco
Santa Cruz de Tenerife

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